Protokol Isolasi RNA Total dengan Metode Guanidine dan Sintesis cDNA

Protokol Isolasi RNA Total dengan Metode Guanidine

RNA atau asam ribonukleat merupakan polimer panjang tidak bercabang yang terdiri dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida ini bersambung dengan ikatan 3’ sampai 5’ fosfodiester. RNA dan DNA terdapat pada semua organisme prokariot dan eukariot. 

Struktur kovalen RNA berbeda dengan DNA dalam dua hal, yaitu unit glukosa dalam RNA merupakan ribosa bukan deoksiribosa, dan satu dari keempat basa utama dalam RNA merupakan urasil (U) yang menggantikan timin (T) pada DNA. 

Isolasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan suatu bagian dari bagian yang lainnya dengan tujuan tertentu. Tujuan dari isolasi RNA adalah digunakan untuk memisahkan RNA dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dan lain-lain) sehingga akan didapatkan RNA yang murni yang dapat dianalisis atau dimodifikasi lebih lanjut. Prinsip untuk isolasi RNA sebenarnya tidak terlalu jauh dengan isolasi DNA. 

Prinsip isolasi RNA terdapat tiga tahapan. Tahap pertama adalah ekstraksi RNA, kemudian presipitasi RNA, dan dilanjutkan dengan permurnian RNA. 

Ekstraksi RNA memiliki metode yang serupa dengan yang digunakan untuk ekstraksi DNA. Akan tetapi, molekul RNA relatif lebih pendek dan sulit rusak dengan pemotongan, sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif dibandingkan dengan ekstraksi pada DNA. Meskipun begitu, RNA sangat mudah dihancurkan oleh enzim RNase yang terdapat endogen dengan konsentrasi bervariasi di dalam sel, dan eksogen di jari tangan. Hal ini menyebabkan untuk melakukan ekstraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat dengan tujuan untuk segera mendenaturasi RNase yang ada. 

Selanjutnya, dilakukan presipitasi RNA yang bertujuan untuk melihat RNA yang sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi. Kemudian, pemurnian RNA dilakukan untuk melihat kemurnian RNA yang diisolasi. Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus dengan nilai absorbansi dan berkorelasi positif. 

Terdapat beberapa metode untuk isolasi RNA. Pada bab ini, hanya akan dibahas mengenai isolasi RNA total dengan metode guanidine. Terdapat tiga metode berbeda untuk preparasi RNA dengan menggunakan metode guanidine, yaitu single-step isolation method­ dengan menggunakan larutas untuk memisahkan ekstraksi RNA total dengan selektif dari sel kultur dan jaringan (basic protocol) dan dua metode yang termasuk dalam tahap CsCI untuk isolasi RNA total (alternative protocols 1 and 2). 

Guanidine thiocyanate merupakan salah satu protein denaturan yang paling efektif. Penggunaan guanidine untuk melisiskan sel awalnya dikembangkan untuk membuat purifikasi RNA dari sel dengan enzim ribonuclease endogen tinggi. 

Single-step RNA isolation dari sel kultur atau jaringan (basic protocol)

Metode ini merupakan metode yang paling sering digunakan untuk isolasi dari RNA total. Metode ini memungkinkan untuk mengganti metode sebelumnya yang panjang dan melelahkan dengan prosedur sederhana yang dapat diselesaikan dalam waktu kurang dari 4 jam. 

Sel kultur atau jaringan dihomogenisasi di dalam larutan denaturasi yang berisi guanidine thiocyanate. Homogenat dicampur dengan 2 M sodium acetate (pH 4), phenol, dan terakhir dengan chloroform/isoamyl alcohol atau bromochloropropane. Hasil campuran larutan kemudian disentrifugasi dan menghasilkan larutan encer yang di bagian atasnya mengandung RNA total. Pada metode ini, ekstraksi RNA total dipisahkan dari protein dan DNA yang tetap di interfase dan di fase organik. Selanjutnya, RNA tadi dilarutkan kembali dengan menggunakan larutan denaturasi (mengandung 4 M guanidine thiocyanate), direpresipitasi dengan isopropanol, dan dicuci deengan 75% ethanol. 

Material

• Larutan denaturasi
• 2 M sodium acetate, pH 4
• Water-saturated phenol
• 49:1 (v/v) chloroform/isoamyl alcohol atau bromochloropropane
• 100% isopropanol
• 75% ethanol (disiapkan dengan DEPC-treated water)
• DEPC-treated water atau deionized formamide yang baru
• Glass Teflon homogenizer
• 5-ml tabung sentrifuge polypropylene
• Sorvall SS-34 rotor (atau ekuivalen)

Homogenisasi sel

• Untuk jaringan: tambahkan 1 ml larutan denaturasi per 100 mg jaringan dan homogenisasi dengan sedikit gerakan pada Glass Teflon homogenizer. Untuk sel kultur: setrifugasi sel suspensi dan buang supernatannya atau pindahkan media kultur dari sel yang tumbuh di kultur monolayer. Tambahkan 1 ml larutan denaturasi per 107 sel dan lewatkan cairan pelisis dengan pipet tujuh sampai sepuluh kali.
• Transfer homogenat ke 5-ml tabung polypropylene. Tambahkan 0.1 ml dari 2 M sodium acetate, pH 4, dan campurkan dengan tabung dibalik secara menyeluruh. Tambahkan 1 ml water-saturated phenol, campurkan menyeluruh, dan tambahkan 0.2 ml dari 49:1 chloroform/isoamyl alcohol atau bromochloropropane. Campurkan secara menyeluruh dan inkubasi suspensi tersebut selama 15 menit pada suhu 0℃-4℃.
• Sentifuge selama 20 menit pada 10,000xg (9000 rpm di SS-34 rotor), 4℃. Transfer bagian atas yang berupa cairan ke dalam tabung yang bersih.

Isolasi RNA

• Presipitatasi RNA dengan menambahkan 1 ml (1 vol) dari 100% isopropanol. Inkubasi sampel tersebut selama 30 menit pada suhu -20℃. Sentrifuge selama 10 menit pada 10,000xg, 4℃ dan buang supernatannya.
• Larutkan RNA pellet di 0.3 ml larutan denaturasi dan pindahkan ke 1.5-ml tabung microcentrifuge.
• Presipitasi RNA dengan 0.3 ml (1 vol) dari 100% isopropanol selama 30 menit pada suhu -20℃. Sentrifuge selama 10 menit pada 10,000xg, 4℃ dan buang supernatannya.
• Suspensikan kembali RNA pellet di 75% ethanol, putar, dan inkubasi 10-15 menit pada suhu ruangan untuk melarutkan sejumlah residual guanidine yang mengkontaminasi pellet.
• Setrifuge selama 5 menit pada 10,000xg, 4℃, dan buang supernatannya. Keringkan RNA pellet di dalam vakum selama 5 menit.
• Larutkan RNA pellet di 100-200 µl DEPC-treated water atau deionized formamide yang baru dengan melewatkan larutan beberapa kali melewati tip pipet. Inkubasikan selama 10 sampai 15 menit pada suhu 55℃ sampai 60℃. Simpan larutan RNA di air pada suhu -70℃ dan larutan RNA di formamide pada suhu -20℃ atau -70℃.

Kuantifikasi RNA

• Kuantifikasi RNA dengan mendilusi 5µl dalam 1 ml air alkalin dan baca pada A260 dan A280.

Purifikasi CsCI RNA dari sel kultur (alternate protocol 1)

Sel dibebaskan dari medium dan dilisiskan dengan menempatkannya di 4 M larutan guanidine. Kekentalan larutan dikurangi dengan menarik lisat dengan menggunakan jarum 20-G dan RNA dipadatkan dengan menggunakan step gradien CsCI. Cairan supernatan dari gradien ini kemudian dipindah dengan hati-hati untuk mendapatkan separasi RNA yang komplit, didapatkan di pellet, dari kontaminasi DNA dan protein. Terakhir, RNA pellet dilarutkan, diendapkan dengan ethanol, dan diukur dengan spektrofometer pada A260. 

Material tambahan (lihat juga di basic protocol)

• Phosphate-buffered saline (PBS)
• Larutan guanidine
• 5.7 M cesium chloride (CsCI), DEPC-treated
• Larutan TES
• 3 M sodium acetate, pH 5.2
• 100% ethanol
• Rubber policeman
• 6-ml jarum 20-G
• Beckman JS-4.2 dan SW 55 rotors (atau ekuivalen)
• 13 x 51-mm silanized dan tabung autoclaved polyallomer ultracentrifuge
• Tambahan reagen dan alat untuk kuantifikasi RNA

Melisiskan sel

Untuk kultur monolayer:

• Cuci sel dalam suhu ruangan dengan menambahkan 5 ml PBS per cawan, aduk dan tuangkan. Ulangi pencucian.
• Tambahkan 3.5 ml larutan guanidine untuk < 108 sel, bagi larutan dengan merata antar cawan. Sel ini harus segera lisis di tempat. Perbaiki kekentalan lisat dengan menggosok cawan dengan rubber policeman. Pindahkan lisat dari cawan dengan menggunakan 6-ml jarum 20-G. Campurkan lisat.

Untuk kultur suspensi: 

• Pellet < 108 sel dengan mensentrifuge selama 5 menit pada 300xg (1000 rpm pada JS-4.2 rotor), pada suhu ruangan, dan buang supernatannya. Cuci sel satu kali pada suhu ruangan dengan mensuspensi kembali pellet pada jumlah PBS sama dengan setengah dari volume sebelumnya dan sentrifuge. Buang supernatannya.
• Tambahkan 3.5 ml larutan guanidine ke dalam tabung sentrifuge.
• Tarik hasil larutan yang sangat kental dengan menaikturunkan sebanyak 4 kali dengan menggunakan 6-ml syringe dengan jarum 20-G. transfer larutan ke dalam tabung bersih.

Isolasi RNA

• Tempatkan 1.5 ml dari 5.7 M CsCi pada 13x51-mm silanized dan tabung autoclaved polyallomer ultracentrifuge. Ambil lapisan 3.5 ml dari sel lisat di bagian atas dari bantalan CsCI untuk membuat step gradien. Antarmuka seharusnya terlihat.
• Sentrifuge selama 12-20 jam pada 150,000xg (35,000 rpm di SW 55 rotor), 18℃. Siapkan sentrifuge pada akselerasi dan deselerasi yang lambat untuk menghindari gangguan gradien.
• Pindahkan supernatan dengan sangat hati-hati. Tempatkan bagian ujung dari pipet Pasteur di bagian atas larutan dan bagian bawah setingkat dengan bagian bawah larutan. Tinggalkan ~100 µl di bagian bawah, balik tabung dengan hati-hati, dan tuang sisa dari cairan.
• Biarkan pellet mengalir selama 5-10 menit, kemudian suspensikan kembali dalam 360 µl larutan TES dengan berulang-ulang mengalirkan larutan naik turun di dalam pipet. Biarkan pellet untuk menjadi suspense dalam 5-10 menit di suhu ruangan. Transfer ke tabung mikrosentrifuge yang bersih.
• Tambahkan 40 µl dari 3 M sodium acetate, pH 5.2, dan 1 ml dari 100% ethanol. Presipitasi RNA selama 30 menit pada dry ice atau ethanol. Mikrosentrifuge selama 10-15 menit pada suhu 4℃ dan buang supernatannya.
• Resuspend pellet dalam 360 µl air dan ulangi tahap 8.

Kuantifikasi RNA

• Alirkan pellet selama 10 menit dan larutkan dengan ~200µl air. Kuantifikasi dengan mendilusi 10 µl dalam 1 ml dengan air alkalin dan baca pada A260 dan A280. Simpan RNA pada -70℃ sebagai larutan cair atau sebagai presipitat ethanol.

Purifikasi CsCI RNA dari jaringan (alternate protocol 2)

Tambahan pencegahan harus diperhatikan ketika purifikasi RNA dari jaringan karena beberapa organ seperti pankreas dan limpa memiliki enzim RNase endogen yang sangat tinggi (hati dan usus memiliki enzim tersebut dalam jumlah yang rendah). 

Material tambahan (lihat juga di alternate protocol 1)

• Liquid nitrogen
• Larutan guanidine jaringan
• 20% (w/v) N-lauroylsarcoisine (Sarkosyl)
• Cesium chloride (CsCI)
• Larutan resuspensi jaringan
• 25:24:1 phenol/chloroform/isoamyl alcohol
• 24:1 chroloform/isoamyl alcohol
• Tissuemizer
• Sorvall SS-34 dan Beckman SW 28 rotors (atau ekuivalen)
• SW 28 tabung polyallomer silanized dan autoclaved

Tahapan:

• Pindahkan jaringan dari hewan dengan cepat dan dinginkan dengan cepat di liquid nitrogen.
• Tambahkan 20 ml larutan guanidine jaringan untuk ~2g jaringan. Giling jaringan dengan tissuemizer dengan segera dengan dua atau tiga kali selama masing-masing 10 detik.
• Sentrifuge selama 10 menit pada 12,000xg (10,000 rpm di SS-24 rotor), 12℃.
• Kumpulkan supernatan dan tambahkan 0.1 vol dari 20% Sarkosyl. Panaskan selama 2 menit pada suhu 65℃.
• Tambahkan 0.1 g CsCI/ml larutan, larutkan CsCI, kemudian lapiskan sampel lebih dari 9 ml dari 5.7 M CsCI di SW 28 tabung silanized, autoclaved polyallomer. Sentrifuge dalam semalam, pada 113,000xg (25,000 rpm di SW 28 rotor), 22℃.
• Pindahkan supernatan dengan hati-hati (lihat di alternate protocol 1, step 6, gambar 8). Balikkan tabung untuk mengalirkan. Potong bagian bawah tabung (yang berisi RNA pellet) dan tempatkan pada 50-ml tabung plastik.
• Tambahkan 3 ml jaringan resuspensi buffer dan biarkan pellet untuk resuspensi semalaman pada suhu 4℃.
• Ekstrak larutan dengan 25:24:1 phenol/chloroform/isoamyl alcohol, kemudian dengan 24:1 chroloform/isoamyl alcohol.
• Tambahkan 0.1 vol dari 3 M sodium acetate, pH 5.2, dan 2.5 vol dari 100% ethanol. Presipitasikan RNA selama 30 menit pada dry ice atau ethanol, mikrosentrifuge selama 10-15 menit pada suhu 4℃, buang supernatannya, dan resuspensi di air. Kuantifikasi RNA dan simpan.

Sintesis cDNA

Sintesis complementary DNA (cDNA) merupakan suatu teknik untuk mendapatkan DNA komplementer dari hasil isolasi RNA sebelumnya. DNA komplementer ini dicetak atau disintesis dari mRNA yang dalam prosesnya dibantu oleh enzim reverse transcriptase. cDNA ini dapat digunakan dalam berbagai kegiatan molekuler dan lebih aman dibandingkan dengan RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarenakan, kestabilan RNA yang mudah terdegradasi oleh RNase. 

DNA komplementer (cDNA) merupakan rantai ganda DNA yang dibuat dari mRNA yang dapat berasal dari prokariot maupun eukariot. Ketika mRNA berhasil diisolasi sebelumnya, maka diperlukan berbagai reagen yang sangat penting untuk proses konversi. Reagen tersebut adalah dNTPs/deoksi nucleotide triphosphate (dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP), primer, dan enzim reverse transcriptase. Hal selanjutnya yang dilakukan adalah mencampurkan mRNA dengan reagen tersebut untuk membuat komplemen dari DNA (sintesis untai pertama). Proses ini kurang lebih membutuhkan waktu 10-60 menit tergantung dari enzim reverse transcriptase yang dipakai. 

Berikut di bawah ini merupakan tahapan dalam pembuatan cDNA (DNA komplementer) dari mRNA dengan menggunakan enzim reverse transcriptase. Terdapat beberapa protokol untuk membuat cDNA. 

Konversi mRNA menjadi cDNA untai ganda ujung tumpul (Blunt-ended Double-stranded cDNA) (basic protocol)

Material

• 5 mM 4dNTP mix
• 5 x reverse transcriptase (RT) buffer
• 200 mM dithiothreitol (DTT)
• 0.5 mg/ml oligo(dT)12–18 (simpan pada suhu -80°C) atau 15-to40-mer antisense primer atau random-hexamer primer
• RNasin ribonuclease inhibitor (simpan pada suhu -20°C)
• AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase
• 10 µCi/µl [α-32P]dCTP (10,000 Ci/mmol)
• 0.5 M EDTA, pH 8.0
• Buffered phenol
• TE buffer, pH 7.5
• Diethyl ether atau 24:1 chloroform/isoamyl alcohol
• 7.5 M ammonium acetate
• 95% and 70% ethanol, ice-cold
• 10% trichloroacetic acid (TCA), ice-cold
• 5× second-strand buffer I
• 5 mM β-NAD+ (simpan pada suhu -80°C)
• RNase H
• E. coli DNA ligase
• E. coli DNA polymerase I
• 5× TA buffer
• 2 µg/ml RNase A, DNase-free
• T4 DNA polymerase
• 10 mg/ml tRNA (simpan pada suhu -20°C)
• 42° and 65°C water baths
• Nitrocellulose membrane filter
• 14°C incubator

Sistesis cDNA

• Siapkan >10µg poly(A) RNA dengan konsentrasi 1µg/µl.
• Panaskan RNA (10 µg dalam 10 µl) di mikrosentrifuge yang ditutup rapat selama 5 menit pada suhu 65℃, kemudian tempatkan segera di dalam es.
• Pada tabung terpisah, tambahkan sesuai urutan (total 180 µl): 20 µl 5mM dNTPs (500 µM final masing-masing), 40 µl 5x RT buffer (1x final), 10 µl 200 mM DTT (10 mM final), 20 µl 0.5mg/ml oligo(dT)12-18 (50 µg/ml final), 60 µl H2O, 10 µl (10 U) RNasin (50 U/ml final). Campurkan dengan memutar, mikrosentrifuge secara singkat, dan tambahkan campuran ke dalam tabung yang berisi RNA. Tambahkan 20 µl (200 U) AMV reverse transcriptase untuk konsentrasi akhir 1000 U/ml di 200 µl. Campurkan dan pindahkan 10 µl untuk dipisahkan ke tabung yang berisi 1 µl dari [α-32P]dCTP. Tinggalkan kedua tabung pada suhu ruangan selama 5 menit, dan tempatkan keduanya pada tabung dengan suhu 42℃, selama 1.5 jam. 
• Tambahkan 1 µl dari 0.5 M EDTA, pH 8.0, untuk reaksi radioaktif dan dinginkan pada suhu -20℃. Ini akan digunakan nanti untuk estimasi jumlah cDNA yang disintesis.
• Untuk reaksi utama, tambahkan 4 µl dari 0.5 M EDTA, pH 8.0, dan 200 µl buffered phenol. Putar, mikrosentrifuge pada suhu ruangan selama 1 menit untuk memisahkan fase, dan transfer bagian atas fase cairan ke tabung baru.
• Tambahkan 100 µl TE buffer, pH 7.5, ke lapisan phenol dan putar, dan mikrosentrifuge seperti di step 5. Pindahkan lapisan cairan dan tambahkan ke fase cairan dari ekstraksi pertama.
• Tambahkan 1 ml diethyl ether, putar, dan mikrosentrifuge seperti di step 5. Pindahkan dan buang bagian atas lapisan dengan pipet kaca. Ulangi ekstraksi dengan tambahan 1 ml ether.
• Tambahkan 125 µl dari 7.5 M ammonium acetate ke fase cairan (konsentrasi final 2.0 sampai 2.5 M) dan 950 µl dari 95% ethanol. Tempatkan pada dry ice atau ethanol bath selama 15 menit, hangatkan pada suhu 4℃, dan mikrosentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan penuh, pada suhu 4℃, untuk menghasilkan pellet asam nukleat. Pellet yang berwarna kuning-putih, kecil mungkin terlihat.
• Pindahkan supernatan dengan pipet, isi penuh tabung dengan ice-cold 70% ethanol, dan mikrosentrifuge selama 3 menit dengan kecepatan penuh, pada suhu 4℃. Pindahkan lagi supernatannya, kemudian keringkan tabung yang berisi presipitat asam nukleat dengan singkat di vacuum desiccator.
• Cairkan tabung yang berisi alikuot radioaktif pada reaksi sintesis untai pertama dan tempatkan sampel pada nitrocellulose membrane filter.
• Cuci membran dengan ice-cold 10% TCA dan tentukan ikatan radioaktif ke filter dengan fluor and scintillation counter. Gunakan aktivitas spesifik radiolabel di dalam reaksi, jumlah RNA yang digunakan, jumlah tergabung, dan efisiensi dari β-counter untuk menghitung jumlah cDNA yang disintesis.

Konversi cDNA ke cDNA untai ganda

• Resuspensi pellet dari sintesis untai pertama pada 248 µl air dan tambahkan ke tabung sesuai urutan (total 400 µl) : 4 µl 5 mM dNTPs (50 µM final masing-masing), 80 µl 5x second strand buffer I (1x final), 12 µl 5 mM β-NAD (150 µM final), 2 µl 10 µCi/ µl [α-32P]dCTP (50 µCi/ µl final). Campurkan dengan diputar, mikrosentrifuge dengan singkat, dan tambahkan: 4 µl (4 U) RNase H (10 U/ml final), 4 µl (20 U) E.Coli DNA ligase (bukan T4 ligase; 50 U/ml final), 10 µl (100 U) E. Coli DNA polymerase I (250 U/ml final). Campurkan dengan diputar, mikrosentrifuge dengan singkat, dan inkubasi selama 12-16 jam pada suhu 14℃.
• Setelah sintesis untai kedua, pindahkan 4 µl dari reaksi ke tabung baru dan dinginkan pada suhu -20℃. Kemudian, tentukan penggabungan radiolabel ked alam bahan yang tidak larut asam seperti yang diuraikan di step 10 dan 11.
• Ekstrak phenol pada reaksi sintesis untai kedua dengan 400 µl buffered phenol dan kembali ekstrak fase phenol dengan 200 µl TE buffer, pH 7.5 seperti di step 5 dan 6.
• Gabungkan kedua fase cairan dan ekstrak kedua dengan 900 µl ether, seperti pada step 7. Volume fase cairan sekarang ~600 µl.
• Bagi fase cairan sama banyak ke dua tabung, tambahkan ammonium acetate, dan presipitat ethanol sebagaimana di step 8 dan 9.

Pembuatan ujung tumpul pada cDNA untai ganda

• Menyelesaikan sintesis untai kedua dan cDNA untai ganda tumpul dengan resuspensi dari penggabungan pellet di 42 µl air. Tambahkan sesuai urutan (total 80 µl):  5 µl 5 mM dNTPs (310 µl final masing-masing), 16 µl 5x TA buffer (1x final), 1 µl 5 mM β-NAD (62 µl final). Campurkan dengan diputar, mikrosentrifuge dengan singkat, dan tambahkan: 4 µl dari 2 µg/ml RNase A (100 ng/ml final), 4 µl (4 U) RNase H (50 U/ml final), 4 µl (20 U) E. Coli DNA ligase (250 U/ml final), 4 µl (8 U) T4 DNA Polymerase (100 U/ml final). Campurkan semua di atas dan inkubasi selama 45 menit pada suhu 37℃.
• Tambahkan 120 µl TE buffer, pH 7.5, dan 1 µl dari 10 mg/ml tRNA. Ekstrak dengan 200 µl buffered phenol dan kembali ekstrak fase phenol dengan 100 µl TE buffer seperti dideskripsikan di step 5 dan 6.
• Gabungkan kedua fase cairan dan ekstrak kedua dengan 1 ml ether seperti pada step 7.
• Presipitat ethanol cDNA seperti pada step 8 dan 9.

Konversi mRNA menjadi cDNA untai ganda (Double-stranded cDNA) untuk kloning terarah (alternate protocol)

Material tambahan (lihat juga basic protocol)

• 5 x SuperScript buffer (RNase-free)
• 0.1 M DTT (RNase-free)
• 3dNTP/methyl-dCTP mix: 10 mM each dATP, dGTP, dTTP, and 5-methyl-dCTP
• 0.25 µg/µl oligonucleotide primer, incorporating (from 5′ to 3′): (dGdA)10, XhoI restriction site, and (dT)18
• 200 U/µl SuperScript or SuperScript II (GIBCO/BRL)
• 5× second-strand buffer II
• 10 mM and 2 mM 4dNTP mix
• 10 µCi/µl [α-32P]dATP (3000 Ci/mmol)
• 0.8 U/µl RNase H
• 10 U/µl E. coli DNA polymerase I
• 1:1 (w/v) phenol/chloroform
• 100% ethanol ice-cold
• 10× Klenow buffer
• 5 U/µl Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I
• 10× mung bean nuclease buffer
• 10 U/µl mung bean nuclease
• 1 M Tris⋅Cl, pH 8.0
• 16°C incubator

Sintesis cDNA

• Persiapkan 5-7 µg poly(A) RNA
• Persiapkan campuran sebelumnya untai pertama (45 µl final dengan mencampurkan sesuai urutan di bawah ini): 10 µl 5x SuperScript buffer, 5 µl 0.1 M DTT, 2.5 µ; 3dNTP/methyl-dCTP mix, 1 µl RNasin, 12 µl 0.25 µg/µl oligonucleotide primer, 14.5 µl H2O
• Resuspensi pellet RNA secara langsung ke dalam campuran sebelumnya. Inkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan, kemudian tambahkan 5 µl dari 200 U/µl SuperScript dan inkubasi selama 1 jam pada suhu 42℃.
• Sesaat sebelum inkubasi selesai, persiapkan larutan sebelumnya untuk untai kedua (336 µl final) yang berisi: 80 µ 5x second-strand buffer II, 6 µl 10 mM 4dNTP mix, 2.5 µl 10 µCi/µl [α-32P]dATP, 247.5 µl H2O. Tempatkan pada es.
• Lanjutkan pada es, tambahkan campuran untai pertama dari step 3 (50 µl total) ke campuran untai ganda sebelumnya yang sudah didinginkan pada step 4.
• Pada tabung mikrosentrifuge kedua, gabungkan 4 µl dari 0.8 U/µl RNase H (3.2 U) dan 10 µl dari 10 U/µl E. Coli DNA polymerase I (100 U). Tambahkan enzim kombinasi ke tabung dari step 5 yang berisi cDNA dan campukan dengan cepat dan dibalik beberapa kali.
• Mikrosentrifuge selama 5 detik dengan kecepatan penuh, kemudian diinkubasi reaksi tersebut selama 1 jam pada suhu 16℃ dan 1 jam pada suhu ruangan.
• Elektroforesis ~2%-5% dari total reaksi pada 0.7% gel agarose, dan monitor rentang ukuran dari cDNA yang sudah dilabeli dengan autoradiografi.

Pembuatan cDNA untai ganda ujung tumpul

• Tambahkan 500 µl dari 1:1 phenol/chloroform ke dalam reaksi. Mikrosentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan penuh untuk fase separasi.
• Pindahkan bagian atas fase ke tabung yang baru, tambahkan 200 µl dari 7.5 M ammonium acetate, dan campurkan dengan dibalik.
• Bagi sampel sama banyak antara dua tabung (300 µl masing-masing). Tambahkan 600 µl ice-cold 100% ethanol ke masing-masing tabung, tempatkan kedua tabung selama 5 menit pada suhu -80℃, kemudian mikrosentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan penuh pada suhu 4℃.
• Tuangkan supernatan dan cuci pellet dengan ice-cold 70% ethanol. Keringkan dengan cepat di Speedvac evaporator. Tambahkan 30 µl air ke salah satu tabung, putar untuk resuspensi pellet cDNA, kemudian transfer isi ke ke dalam tabung kedua.
• Tambahkan tambahan 10 µl air, 5 µl dari 10x Klenow buffer, dan 5 µl dari 2 mM-4dNTP dan campurkan pada tabung pertama. Putar dan transfer ke tabung kedua. Tambahkan 5 µl dari 10 U/µl Klenow fragment ke tabung kedua dan inkubasi selama 30 menit pada suhu 37℃.
• Tambahkan 50 µl dari 1:1 phenol/chloroform ke dalam reaksi, dan transfer bagian atas fase ke tabung yang baru. Ekstrak kembali bagian bawah fase dengan menambahkan 50 µl air dan kombinasikan dengan ekstraksi pertama.
• Tambahkan 50 µl dari 70 M ammonium acetate dan 300 µl ice-cold 100% ethanol. Tempatkan pada -80℃ selama 5 menit, kemudian mikrosentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan penuh, 4℃.
• Tuangkan supernatan dan cuci pellet dengan ice-cold 70% ethanol. Keringkan pellet dengan singkat di Speedvac evaporator. Resuspensi cDNA di 225 µl air.
• Tambahkan 25 µl dari 10x mung bean nuclease buffer dan 1 µl dari 1 U/µl mung bean nuclease. Inkubasi selama 15 menit pada suhu 37℃.
• Tambahkan 25 µl dari 1 M Tris Cl, pH 8.0. Ekstrak dengan 200 µl 1:1 phenol/chloroform dan ekstrak kembali dengan 50 µl air, gabungkan bagian atas fase di tabung baru.
• Tambahkan 175 µl dari 7.5 M ammonium acetate dan penuhi tabung dengan ice-cold 100% ethanol. Tempatkan pada -80℃ selama 5 menit, kemudian mikrosentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan penuh, 4℃.
• Cuci pellet dengan 70% ethanol dan udara kering secara singkat. Resuspensi di 20 µl air, kemudian tambahkan 2.5 µl dari 10x Klenow buffer dan 1 µl dari 5 U/µl Klenow fragment. Inkubasi selama 5 menit pada suhu 37℃. Tambahkan 2.5 µl dari 2 mM dNTP campurkan ke reaksi dan inkubasi sebagai tambahan selama 25 menit pada suhu ruangan.
• Tambahkan 25 µl dari 1:1 phenol/chloroform ke dalam reaksi dan ekstrak, pindahkan bagian atas fase ke tabung baru. Ekstraksi kembali bagian bawah fase dengan tambahan 25 µl air dan gabungkan dengan bagian atas fase. Simpan sampel dingin pada suhu -20℃ sampai dengan siap untuk step ligase EcoRi adaptor.

DAFTAR PUSTAKA

• Sargent T. Current protocols in molecular biology. Vol. 171, Analytical Biochemistry. 1988. 223–224 p.
• Chomczynski P, Wilfinger W, Mackey K. Single-Step Method of Total RNA Isolation by Guanidine-Phenol Extraction. eLS. 2017;1–6.
• C STN, C AAK, C NSY, Aprilia E, C W, C SRS, et al. Laporan Praktikum m . k Bioteknologi Akuakultur Material dan Prosedur Hasil. 2014;2–5.
• Susan C. Isolation of Total Rna Using Guanidine Thiocyanate. :5–8.