Isolasi dan Purifikasi DNA 

Isolasi dan purifikasi DNA diperlukan selanjutnya untuk proses insersi DNA dalam proses kloning. Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah DNA genom dan DNA plasmid yang berasal dari sel bakteri. 

Isolasi dan Purifikasi DNA Genom

Isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa tahapan, yaitu: 

• Kultivasi sel dalam media yang sesuai
• Pemecahan atau melisiskan dinding sel. Pemecahan dinding sel bakteri dapat dilakukan secara fisik, misalnya dengan cara sonifikasi. Selain itu, dapat dilakukan dengan cara kimiawi, yaitu dengan pemberian enzim lisozim, atau etilen diamin tetra asetat (EDTA). Pelisisan dinding bakteri pun dapat dilakukan dengan cara keduanya. Sering kali, pemecahan dinding sel bakteri cukup dilakukan dengan enzim lisozim dan EDTA. Akan tetapi, sering kali juga ditambahkan bahan lain, yaitu deterjen triton X-100, atau sodium dedosil sulfat (SDS). Selanjutnya dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan debris sel. Komponen sel yang tidak larut akan diendapkan dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel dalam supernatant yang jernih.
• Ekstraksi DNA genom
• Purifikasi DNA. Umumnya proses permurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau campuran fenol dan kloroform (1:1). Selanjutnya dilakukan sentrifugasi untuk mengendapkan protein. Selanjutnya, perlu ditambahkan RNase untuk membersihkan DNA dari RNA.

Isolasi dan Purifikasi DNA Plasmid 

Pada umumnya sama caranya dengan cara isolasi dan purifikasi DNA genom. Sel bakteri yang mengandung DNA plasmid dibiakkan dan dipanen. Dinding sel bakteri kemudian dilisiskan dengan menggunakan deterjen dan enzim lisozim, kemudian disentrifugasi. Perbedaan penting dalam isolasi DNA plasmid dan genom adalah pada isolasi DNA plasmid memperhatikan keberadaan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pemisahan antara DNA plasmid dengan DNA genom sangat penting dilakukan apabila DNa plasmid akan digunakan sebagai vektor dalam proses kloning. Adanya kontaminasi DNA genom bakteri dalam jumlah sedikit pun dapat mempengaruhi keberhasilan kloning DNA. 

Pemisahan DNA plasmid dengan DNA genom berdasarkan ukuran dan konformasinya. Ukuran DNA plasmid sangat kecil jika dibandingkan dengan DNA genom. Oleh karena itu, penting untuk memisahkan molekul DNA yang kecil dengan DNA yang berukuran besar. Salah satu cara yang sering digunakan adalah dengan menggunakan sentrifugasi gradien densitas. 

Terdapat beberapa metode untuk isolasi dan pemurnian fragmen restriksi DNA. Protokol dasar untuk hal ini dilakukan dengan melibatkan electroelution fragmen yang diinginkan dari gel agarosa standar menggunakan kantung dialisis penyangga-buffer, diikuti oleh konsentrasi dan pemurnian menggunakan kolom Elutip. Metode ini dapat digunakan untuk fragmen dengan ukuran 50 sampai 20.000 bp. Selanjutnya, ada metode elektroforesis langsung ke kertas NA-45 yang memberikan hasil relatif tinggi untuk fragmen ≤ 2000 bp. Selanjutnya, untuk fragmen ≥1000 bp dapat dipisahkan pada gel rendah/pencairan gel agarosa dan dimurnikan dengan ekstraksi fenol, atau pemecahan gel β-agarase, atau melalui silika kolom membran berputar. 

Electroelution dari Gel Agarosa

Material:

• DNA encoding yang diinginkan
• Enzim restriksi dan buffer yang sesuai
• Larutan etidium bromide
• TAE buffer
• Larutan Elutip tinggi garam
• 2,5 M NaCl
• Larutan Elutip rendah garam
• 100% dan 70% etanol
• TE buffer pH 8,0
• Spectrapor 3 tabung membran dialisis (diameter 11,5 mm dengan MWCO dari 3500)
• Elutip-d kolom
• Jarum suntik kecil (misalnya, 5-ml)
• Reagen tambahan dan peralatan untuk enzim restriksi, elektroforesis gel agarose, dan fotografi

Memilih dan Elektroforesis Preparat Gel Agarosa

• Pemecahan 0,1-25 ug DNA dengan enzim restriksi yang sesuai.
• Sampel dimasukan ke dalam gel agarosa yang sesuai dan dilakukan elektroforesis.
• Setelah elektroforesis, beri warna gel dengan larutan etidium bromida dan foto gel tersebut.

Electroelute DNA

• Dengan menggunakan lampu UV untuk memvisualisasikan band, hati-hati memotong pita target dengan pisau bedah.
• Bilas tabung dialisis dengan TAE buffer.
• Ikat kuat salah satu ujung tabung dengan dua knot. Geser potongan gel ke dalam pipa. Isi tabung dengan TAE buffer sampai hampir sepenuhnya mengembang. Knot atau klip bagian atas tabung sampai tertutup.
• Tempatkan kantung dialisis yang disegel dalam alat elektroforesis gel secara horisontal. Isi alat dengan 1 × TAE buffer sampai kantung dialisis tertutup dengan larutan.
• Electroelute pada tegangan konstan ~2 V/cm antara dua kabel. Untuk sasaran fragmen 50- untuk 500-bp, electroelute 30 sampai 45 menit. Untuk fragmen 500 sampai 2000-bp, electroelute 2 jam. Untuk fragmen 2000- 4000-bp, electroelute 4 jam. Untuk fragmen yang lebih besar, electroelute pada 1 V / cm semalaman.
• Setelah electroelution selesai, kembalikan polaritas elektroda dan hidupkan tegangan pada 100 V selama 30 detik.
• Hati-hati membuka bagian atas kantung dialisis dan kumpulkan TAE buffer dengan pipet Pasteur. Pijat slice gel keluar dari kantong dan cuci kantung dengan pipet dari TAE buffer.

Konsentrasikan dan Pemurnian Electroeluted DNA dengan Elutip-d

• Basahi kolom Elutip-d dengan larutan Elutip tinggi garam. Tempatkan 2 ml larutan tinggi garam dalam jarum suntik kecil. Tempelkan jarum suntik pada kolom Elutip-d dan dorong larutan tinggi garam melalui kolom.
• Seimbangkan kolom dengan larutan Elutip rendah garam. Tempatkan 5 ml larutan rendah garam di jarum suntik dan dorong larutan melalui kolom.
• Sesuaikan salinitas sampel DNA untuk dimurnikan menjadi 0,2 M NaCl dengan 2,5 M NaCl. Ambil larutan DNA dalam jarum suntik dan masukkan ke dalam kolom.
• Cuci kolom dengan 5 ml larutan rendah garam.
• Elusi DNA dengan 400 ml larutan tinggi garam. Kumpulkan larutan dalam 1,5-ml tabung microcentrifuge.
• Tambahkan 1 ml 100% etanol untuk 400 ml elusi DNA. Endapkan pada -20 ° C. Pelet DNA, dicuci di 70% etanol, dan keringkan. Resuspend dalam jumlah yang diinginkan dengan TE buffer pH 8,0, dan digunakan untuk manipulasi lebih lanjut dan kuantitasi.

Elektroforesis dnegan Kertas Na-45

Prosedur ini lebih sederhana dibandingkan Basic Protocol 1, karena tidak memerlukan manipulasi irisan gel dan kantung dialisis. Ini terutama cocok untuk fragmen DNA kecil (yaitu <2000 bp). 

Material:

• Agarosa ultrapure
• Kertas NA-45
• TE buffer pH 8,0
• NA-45 elusi buffer
• Buffered fenol
• 25: 24: 1 (v / v / v) fenol / kloroform / isoamil alkohol
• 95% dan 70% etanol, ice-cold
• Tang datar, dua pasang
• Reagen tambahan dan peralatan untuk elektroforesis gel agarosa, dan ekstraksi dan presipitasi DNA

Tahapan:

• Pemecahan DNA dengan enzim restriksi yang sesuai dan masukkan ke gel yang sudah disiapkan dengan agarose ultrapure
• Elektroforesis pada tegangan yang sesuai sampai fragmen DNA terpisah dari kontaminan, dinilai dengan visualisasi dengan lampu UV genggam.
• Hentikan elektroforesis dan dengan menggunakan pisau bedah yang bersih atau silet, potong sedikit di atas dan bawah dari fragmen.
• Masukkan sepotong kecil kertas NA-45 ke masing-masing celah dengan hati-hati dengan cara memisahkan dengan forceps datar sambil menempatkan kertas di celah yang lain dengan set forsep yang lain.
• Tekan perlahan pada bagian atas dan bawah gel untuk memastikan bahwa celah berkontak dengan kertas. Elektroforesis selama 10 menit pada tegangan yang sama dengan sebelumnya, atau sampai DNA telah bermigrasi ke kertas.
• Hati-hati memindahkan kertas yang berisi fragmen DNA yang diinginkan dengan forsep. Cuci kertas perlahan sebanyak tiga kali dengan TE buffer pH 8,0.
• Pindahkan kertas yang telah dicuci ke tabung microcentrifuge 1,5 ml yang mengandung 400 ml NA-45 elution buffer. Panaskan hingga 70°C selama 15 menit untuk fragmen pendek (<500 bp) atau 1 jam untuk fragmen yang lebih besar (> 1500 bp).
• Ekstrak satu kali dengan 400 ml buffered fenol. Ekstrak kembali fase cairan sebanyak dua kali dengan fenol / kloroform / isoamil alkohol, kemudian ekstrak dua kali dengan kloroform.
• Tambahkan 1 ml etanol 95% dan endapkan semalaman di suhu -20°C.
• Microsentrifuge dengan kecepatan tinggi dan cuci pelet dengan 70% etanol yang didinginkan sampai -20°C. Resuspensikan DNA dalam TE buffer pH 8,0.

Isolasi Fragmen DNA dengan menggunakan Low Gelling/Melting Temperature Gel Agarosa

Material:

• DNA yang akan diisolasi
• Enzim restriksi dan buffer yang sesuai
• Low gelling/melting temperature gel agarose
• Larutan etidium bromide
• TE buffer pH 8,0
• Buffered fenol
• Larutan Elutip tinggi garam dan rendah garam
• Pisau bedah
• Kolom Elutip-d
• Beckman JS-13 swinging-bucket rotor
• Reagen tambahan dan peralatan untuk enzim restriksi, elektroforesis gel agarosa, dan presipitasi etanol

Tahapan:

• Pemecahan sampel DNA sampai selesai dengan enzim restriksi yang sesuai. Tuangkan, masukkan. dan elektroforesis pada 1% low gelling/melting temperature gel agarosa.
• Warnai gel dengan larutan etidium bromida dan potong band dengan pisau bedah. Lelehkan potongan gel pada 65°C dan tambahkan TE buffer, pH 8,0 secukupnya, untuk mengurangi persentase agarosa menjadi ≤0.4%.
• Jika DNA akan digunakan untuk ligasi, transformasi, atau digesti oleh restriksi endonuklease, gunakan larutan molten secara langsung. Untuk mengisolasi fragmen, langsung gunakan kolom Elutip-d, lanjutkan ke step 8 dan 9. Untuk memindahkan agarosa dengan ekstraksi fenol, lanjut ke step 4.
• Tambahkan volume yang sama dari buffered fenol dan campurkan selama 5-10 menit. Sentrifuge selama 10 menit pada 15.800 × g (10.000 rpm dalam Beckman JS-13 rotor), pada suhu ruangan.
• Kumpulkan fase cairan dan sisihkan. Ekstrak kembali fase fenol dan interfase dengan volume yang sama dari TE buffer pH 8,0. Sentrifugasi seperti pada step 4.
• Kumpulkan fase cairan kedua. Jika interfase besar masih muncul, ekstrak kembali untuk ketiga kalinya.
• Endapkan ethanol yang digabungkan dengan fase cairan. Untuk memurnikan larutan DNA lebih lanjut dengan kolom Elutip-d (step 8 dan 9) atau gunakan langsung setelah di resuspensikan di penyangga yang sesuai.
• Tambahkan 10-20 vol larutan Elutip rendah garam.
• Murnikan fragmen DNA dengan menggunakan kolom Elutip-d (lihat pada basic protocol, step 11-16), pertahankan semua larutan pada suhu 37°C.

Pemulihan DNA dari Low Gelling/Melting Temperature Gel Agarosa menggunakan Pemisahan B-Agarase

Material tambahan:

• beta-agarase I
• beta-agarase buffer
• Tambahan reagen dan bahan untuk dialisis dan pengendapan DNA dengan isopropanol

Tahapan:

• Siapkan low gelling/melting temperature gel agarosa (lihat pada basic protocol 3, step 1 dan 2).
• Transfer irisan gel ke tabung yang bersih. Cuci sebanyak dua kali selama 30 menit masing-masing pada es dengan 2 vol dari 1 × beta-agarase buffer. Tambahkan volume yang sama dari β-agarase buffer ke irisan gel yang sudah dicuci.
• Lelehkan gel sepenuhnya dengan pemanasan selama 10 menit pada suhu 65°C.
• Seimbangkan molten agarosa sampai 40°C (selama ~10 menit). Tambahkan 1 U β-agarase untuk setiap 200 ml 1% agarose dan inkubasi dilanjutkan sampai 1 jam.
• Jika DNA akan digunakan untuk ligasi, transformasi, atau digesti resktriksi endonuklease, gunakan larutan β-agarase molten/larutan DNA secara langsung. Untuk memurnikan fragmen besar selanjutnya (>50 kb), dialisis larutan DNA untuk menghapus karbohidrat dan β-agarase. Untuk memurnikan fragmen kecil, ikuti step 6-9.
• Untuk memurnikan fragmen kecil (<50 kb), sesuaikan konsentrasi garam dari β-agarase/larutan DNA untuk 0,5 M NaCl dan tambahkan volume yang sama dari isopropanol. Dinginkan selama 15 menit di atas es.
• Sentrifuge selama 15 menit pada 15.000 × g untuk pelet dari karbohidrat yang tidak tercerna dan transfer supernatan ke tabung yang bersih.
• Tambahkan 2-3 vol isopropanol, aduk yang rata, dan dinginkan selama 30 menit pada suhu 0°C.
• Sentrifuge selama 15 menit pada 15.000 × g, supernatan dibuang, dan keringkan pelet. Resuspensi di TE buffer pH 8,0, atau buffer yang tepat untuk manipulasi berikutnya.

Pemulihan DNA dari Agarosa dengan menggunakan Kolom Silika Membrane Spin

Material tambahan (lihat juga Basic Protocol):

• Larutan 6.0 M NaI (disaring melalui kertas saring, simpan hingga 3 bulan dalam ruangan gelap di suhu 4°C)
• Binding buffer
• Wash buffer
• TE buffer pH 8,0 atau nuclease-free H2O
• Tabung microcentrifuge 1,5-ml
• 45°-50°C water bath
• Silica membrane spin columns

Tahapan:

• Pemecahan sampel DNA, tuangkan, masukkan, dan elektroforesis melalui 1% gel agarosa, dan warnai gel dengan menggunakan ethidium bromide. Potong band target dengan pisau bedah yang bersih dan transfer ke tabung mikrosentrifuge 1,5-ml.
• Perkirakan volume agarose (biasanya ~100 ml) dan tambahkan 2,5-3,0 vol larutan 6,0 M natrium iodida (250 sampai 300 ml).
• Inkubasi selama 5 menit pada suhu 45° sampai 50°C untuk melarutkan agarosa tersebut.
• Tempatkan tabung pada suhu ruangan, tambahkan 2 vol binding buffer (700-800 ml), dan campurkan dengan baik.
• Masukkan supernatan ke silica membrane spin columns.
• Mikrosentrifuge spin columns dalam tabung koleksi selama 1 menit dengan kecepatan maksimum. Pindahkan spin columns dari tabung koleksi dan buang flow-through. Masukkan kembali spin columns ke dalam tabung koleksi.
• Cuci spin columns dengan menambahkan 750 ml wash buffer dan mikrosentrifuge selama 1 menit pada kecepatan maksimum. Pindahkan spin columns dari tabung koleksi dan buang flow-through.
• Masukkan kembali spin columns dalam tabung koleksi dan mikrosentrifuge untuk satu menit tambahan untuk menghilangkan sisa wash buffer (etanol) dari spin columns.
• Transfer spin columns ke tabung mikrosentrifuge 1,5 ml dan tambahkan 75-100 ml air nuclease-free atau TE buffer, pH 8,5, ke pusat membran. Diamkan selama 2-10 menit, kemudian mikrosentrifuge selama 1 menit pada kecepatan maksimum.
• Kumpulkan DNA dan simpan pada suhu 4°C sampai akan digunakan.

Pemindahan Fragmen Oligonukleotida menggunakan Kolom Sephacryl S-300

Material tambahan (lihat juga Basic Protocol)

• 50% (v / v) Sephacryl S-300 di TE buffer pH 8,0 (Sephacryl/TE), tersimpan tertutup pada suhu 4 ° C
• 0,3 M NaCl di TE buffer pH 8,0 (NaCl/larutan TE)
• sampel DNA dalam larutan NaCl / TE
• Glass wool plug and 6-in. Pasteur pipet, silanized

Tahapan:

• Tuangkan ~ 10 ml dari resuspensi 50% Sephacryl S-300 / TE buffer mixture ke dalam tabung. Biarkan sephacryl untuk menetap.
• Pindahkan TE buffer dan tambahkan ~ 10 ml larutan NaCl/TE. Campurkan, biarkan sephacryl untuk menetap, dan ulangi.
• Tempatkan silanized glass wool plug di dalam 6-in. silanized Pasteur pipet. Tuangkan equilibrated Sephacryl ke dalam kolom. Lanjutkan dengan menambahkan campuran sampai tingkat Sephacryl berada lekukan pada pipet (~ 1 inchi dari atas). Setelah kolom dikemas, cuci dengan 2 ml larutan NaCl/ TE.
• Masukkan 200 ml sampel DNA ke dalam kolom dan kumpulkan 200 ml pertama yang elute-ini adalah fraksi 1.
• Tambahkan 100-ml aliquot larutan NaCl/TE untuk kolom dan kumpulkan 12-14 100-ml fraksi.
• Campurkan fraksi 8 sampai 11. Tambahkan 2,5 vol etanol dan endapkan. Sentrifuge dan pulihkan pelet, yang berisi fragmen DNA bebas oligonukleotida.