Protective Effect of Triterpenes of Ganoderma lucidum on Lipopolysaccharide-induced Inflammatory Responses and Acute Liver Injury

Pendahuluan/Latar Belakang 

Inflamasi merupakan suatu respon tubuh yang berkontribusi pada patogenesis dari berbagai macam penyakit. Sebagai garis terdepan dari mekanisme pertahanan terhadap patogen, fagosit mononuklear melalui berbagai tipe dari reseptor pengenalan (PRRs) mengetahui bahwa mikroba dan sel pejamu rusak oleh karena infeksi, seperti toll-like receptors (TLR), NOD-like receptors, dan HIN-200, yang menghasilkan inisiasi dari respon imun untuk mengatur respon inflamasi protektif melawan mikroba yang berbahaya. Toll-like receptor 4 (TLR 4), reseptor untuk lipopolisakarida (LPS), yang menginduksi interaksi antara TLR4 dengan molekul adaptor MyD88, dan menghasilkan aktivasi dari downstream MAPK dan NF-κB untuk induksi mediator inflamasi. Meskipun respon inflamasi memiliki peran yang penting dalam pertahanan tubuh melawan infeksi mikroba, produksi berlebihan atau tidak terkontrol dari mediator inflamasi memiliki efek dalam memediasi atau eksaserbasi beberapa penyakit metabolik inflamasi kronis, seperti aterosklerosis, diabetes melitus tipe 2, gout, colitis, dan penyakit Alzheimer. Sehingga, mengatur respon inflamasi merupakan strategi yang menjanjikan untuk mengobati penyakit, namun terapi untuk mengontrol efek merugikan dari respon inflamasi yang overaktif masih kurang. 

Ganoderma lucidum (G. lucidum) termasuk ke dalam keluarga ganodermaceae dari polyporales, yang merupakan suatu jenis jamur dengan efek farmakologi yang penting, dan sudah digunakan sebagai pengobatan tradisional di China selama berabad-abad. G. lucidum melindungi hati dan ginjal dan digunakan sebagai anti-hipertensi, anti-hiperlipidemia, dan anti-kanker, dan efek bermanfaat lainnya. G. lucidum telah digunakan sebagai pengobatan untuk berbagai macam penyakit, termasuk hepatitis kronis, nefritis, dan diabetes. Triterpenes merupakan komponen mayor dari G. lucidum yang juga digunakan sebagai anti-inflamasi, anti-tumor, dan antioksidan. Namun, mekanisme molekuler yang mendasari inhibisi dari triterpenes terhadap LPS yang menginduksi respon inflamasi dan cedera hati akut belum diketahui dengan pasti. 

Pada penelitian ini, peneliti menerangkan bahwa LPS yang menginduksi respon inflamasi secara signifikan dihambat oleh ekstrak ethanol dan triterpenes dari G. lucidum. Selanjutnya, ganodermanontriol menghambat D-Ga1N/LPS yang menginduksi cedera hati. Peneliti juga menemukan bahwa ganodermanontriol mencegah aktivasi dari jalur sinyal NF-κB dan MAPK yang dimediasi oleh TLR4-MyD88 pada LPS yang menginduksi respon inflamasi. Oleh karena itu, triterpenes dari G. lucidum dapat menjadi agen terapeutik yang potensial untuk penyakit inflamasi. 

Metode 

Objek penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit betina BALB/c yang berusia 6-8 minggu. Mencit kemudian disimpan di fasilitas yang spesifik bebas pathogen di Universitas Inner Mongolia. Selain itu juga digunakan sel lini makrofag Ana-1 yang ditumbuhkan di RPMI640 dan ditambah dengan 10% FBS (fetal bovine serume), 100 U/ml penisilin, dan 100 U/ml streptomisin, pada suhu 37℃ dan atmosfer yang berisi 5% CO2. Ekstrak ethanol dan triterpenes dari G. lucidum didapatkan dari G. lucidum kering dan cincang diekstrak tiga kali dengan CHCl3 dengan refluxing selama 3 jam untuk mendapatkan ekstrak padat. Ekstrak kasar kemudian dielusikan melewati kolom gel silika dengan hexane-acetone dan CHCl3-MeOH. Selanjutnya, triterpenes dipisahkan dengan kromatografi kolom gel silika ke dalam enam fraksi dengan menggunakan hexane-acetone gradient. 

Selanjutnya, peneliti melakukan pemeriksaan viabilitas sel dengan MTT assay pada sel lini. Pengukuran konsentrasi sitokin (IL-1β, IL-6, dan PEG2) dengan menggunakan ELISA pada sel bebas supernatant dan jaringan hati yang telah dihomogenisasi. Pengukuran produksi nitrit diukur di dalam fraksi media oleh Greiss reaction. Selanjutnya, pengukuran NF-κB dengan imunofluoresensi indirek menggunakan antibodi p65 dan DAPI untuk mewarnai nukleus pada sel lini. Pewarnaan H&E dari sampel jaringan hati difiksasi dengan larutan formalin (4%). Western blot selanjutnya dilakukan untuk mengetahui transduksi sinyal pada proses penelitian ini dari sel lini Ana-1. 

Mencit betina BALB/c yang berusia 6-8 minggu dirandomisasi ke dalam enam kelompok (masing-masing kelompok 7-8 mencit) yaitu kelompok kontrol, model (LPS/D-Ga1N), yang diterapi dengan ganodermanontriol (5,10,20 mg/kg), dan yang diterapi dengan dexameathone (20mg/kg, kontrol positif). Mencit diberikan ganodermanontriol atau dexameathone selama 7 hari berturut-turut. Untuk menginduksi cedera hati akut, mencit diinjeksi intraperitoneal dengan campuran D-Ga1N (700mg/kg) dan LPS (35 µg/kg). Setelah 7 hari, mencit dikorbankan dan darah serta jaringan hati dikumpulkan untuk pemeriksaan selanjutnya dan diukur kadar AST dan ALT. 

Hasil Penelitian 

Dari pemeriksaan MTT assay didapatkan bahwa dosis ekstrak ethanol G. lucidum (0-25 µg/ml), G. lucidum karst, dan G. sinensis (0-50 µg/ml) tidak toksik terhadap viabilitas sel makrofag Ana-1, tetapi memiliki efek terhadap viabilitas sel pada konsentrasi yang tinggi (100 µg/ml). Sehingga, data tersebut menjelaskan bahwa G. lucidum layak untuk penelitian anti inflamasi pada konsentrasi yang rendah. 

Selanjutnya, didapatkan bahwa ekstrak ethanol G. lucidum, G. lucidum karst, dan G. sinensis menghambat sekresi IL-1β, IL-6, dan TNF-α, serta PEG2. Produksi nitrit oksida (NO), suatu mediator inflamasi, dicegah oleh ekstrak tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak ethanol G. lucidum berperan dalam proteksi melawan LPS yang menginduksi respon inflamasi. 

Triterpenes dari G. lucidum juga membatasi produksi dari mediator pro inflamasi, seperti IL-1β, IL-6, TNF-α, PEG2, dan NO. Triterpenes pada dosis 0-25 µg/ml tidak toksik terhadap viabilitas sel. Hal ini menunjukkan bahwa triterpenes juga dapat mencegah LPS yang menginduksi respon inflamasi sesuai dengan ekstrak ethanol G. lucidum. 

Dari penelitian ini juga didapatkan bahwa LPS yang mengstimulasi fosforilasi p65 pada Ser536 menjadi hipofosforilasi dengan adanya ganodermanontriol dibandingkan dengan sel kontrol sesuai dengan kenaikan dosisnya. Ganodermanontriol juga melemahkan LPS yang mengstimulasi fosforilasi IκBα pada Ser536. Selanjutnya, ganodermanontriol ditemukan mencegah LPS yang menstimulasi translokasi nukleus p65 di sel makrofag Ana-1. Hal ini menunjukkan bahwa jalur sinyal NF-κB merupakan satu target molekular yang berkontribusi efek anti-inflamasi triterpenes dari G. lucidum. Selanjutnya, ganodermanontriol secara signifikan menghambat LPS yang menginduksi kadar phospho-p38, phospho-p44/42, dan phosphor-SAPK/JNK sesuai dengan kenaikan dosis, tetapi kadar total p38, p44/42, dan SAPK/JNK masih tidak berubah. Hal ini menunjukkan bahwa jalur sinyal MAPK juga merupakan target untuk efek anti-inflamasi triterpenes dari G. lucidum. 

Penelitian ini juga mendapatkan bahwa ganodermanontriol menurunkan ekspresi protein dari TLR4, yang diinduksi oleh LPS di sel makrofag Ana-1. Selanjutnya, ganodermanontriol memiliki efek inhibisi dari peningkatan ekspresi MyD88. Ganodermanontriol juga dapat mencegah ekspresi mediator inflamasi COX-2, sesuai dengan kenaikan dosis. Hal ini menunjukkan bahwa triterpenes dari G. lucidum dapat menghambat aktivasi jalur TLR4-MyD88, yang mungkin berkontribusi pada efeknya melawan pelepasan mediator inflamasi pada LPS yang menginduksi sel makrofag Ana-1. 

Selanjutnya, pada jaringan hati mencit model D-Ga1N dan LPS yang menginduksi cededa hati yang mendapatkan terapi ganodermanontriol, didapatkan hanya ada titik nekrosis dari hepatosit dan sedikit reaksi inflamasi, dibandingkan dengan mencit model tanpa terapi didapatkan adanya nekrosis difus dan parah yang berhubungan dengan inflamasi akut panlobular. Tidak ada perbedaan kadar ALT, AST, dan seklresi TBil dengan adanya ganodermanontriol ataupun tidak. Pemberian injeksi LPS/D-Ga1N menginduksi peningkatan kadar TNF-α dan IL-6 hati. Hal ini menunjukkan bahwa triterpenes dari G.lucidum menghambat D-Ga1N dan LPS yang menginduksi cedara hati pada mencit. Triterpenes dari G.lucidum menghambat LPS yang menginduksi respon inflamasi di makrofag. 

Kesimpulan 

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa triterpenes dari G.lucidum memainkan peran yang penting dalam menghambat LPS yang menginduksi respon inflamasi secara in vitro dan cedera hati akut secara in vivo. Ekstrak ethanol G. lucidum dan triterpenes dari G. lucidum yang dapat menghambat sekresi mediator pro inflamasi (IL-1β, IL-6, TNF-α, PEG2, dan NO). Jalur sinyal MAPK dan NF-κB merupakan target untuk efek anti-inflamasi triterpenes dari G. lucidum. Triterpenes dari G. lucidum juga dapat menghambat aktivasi jalur TLR4-MyD88, yang berkontribusi pada efeknya melawan pelepasan mediator inflamasi pada LPS yang menginduksi respon inflamasi. Triterpenes dari G.lucidum juga menghambat D-Ga1N dan LPS yang menginduksi cedara hari pada mencit (in vivo).